Whooping cough (pertussis) is a highly contagious acute respiratory disease caused by the strict human pathogen Bordetella pertussis, a gram-negative coccobacillus. The worldwide mass-vaccination was started in 1940s and to date, a number of whole-cell (Pw) and acellular pertussis vaccine (Pa) formulations were developed. Yet the current vaccines are incapable of providing sustained, lifelong immunity and eliminating subclinical infections, which pose a threat especially for unimmunized infants as well as adolescents and adults. Thus, finding new protein candidates with high immune protective capacities is necessary to enhance the clinical efficacy of current acellular pertussis (Pa) vaccines.In this study, iron-superoxide dismutase (FeSOD) protein was investigated for its capacity of conferring protectivity as well as stimulating humoral and cellular responses against B. pertussis infection in a mouse model. For this purpose, sodB gene, which encodes iron-superoxide dismutase FeSOD protein, was amplified from the genomic DNA of the universal B. pertussis strain `Tohama I? and sequentially cloned to pGEM®-T subcloning and pET-28a(+) expression vectors. Afterwards sodb/pET28a(+) construct was introduced to E. coli BL21(DE3) cells and the gene was overexpressed therein via IPTG induction. The expressed FeSOD protein was then purified by affinity chromatography and its previously reported immunogenicity was confirmed by Western blot. After filter-sterilization, the protein was adsorbed to alum [Al(OH)3] adjuvant and introduced to BALB/c twice at three weeks intervals intraperitoneally at a concentration of 20 ?g purified FeSOD protein/mouse. Another group of mice were immunized in tandem with heat-inactivated whole-cell suspension of B. pertussis. Ten days after the second immunization, mice were intranasally challenged with the local `Saadet? strain of B. pertussis. Next the lungs of groups of mice were excised, homogenized and plated as serial dilutions on days 5, 8 and 14 post-challenge, and viable lung CFU counts were carried out. Whole cell immunization conferred complete bacterial clearance following B. pertussis intranasal infection while FeSOD immunization failed to attain such protection. In addition to the protectivity assay, ELISA was performed to assess the humoral (i.e. IgG) immune response triggered upon FeSOD- and whole-cell immunizations and a statistically significant increase in anti-FeSOD IgG production was observed in FeSOD-immunized group. Finally, cellular immune response was tested via cytokine (IFN-?) assay, in which spleens of mice were excised, splenocytes were cultured and the level of IFN-? production upon FeSOD addition to the cultures was measured via ELISA. This test showed that whole-cell immunization triggered IFN-? production at significant levels while FeSOD-immunization did not; indicating the failure of alum-adsorbed FeSOD immunization in inducing cell-mediated immune response.

Boğmaca (pertussis), tek konağı insan olan Bordetella pertussis gram-negatif kokobasilinin sebep olduğu oldukça bulaşıcı bir solunum yolu hastalığıdır. 1940'larda dünya çapında geniş kapsamlı bir aşılama süreci başlamış ve bugüne kadar hastalığa karşı çeşitli tüm hücre ve asellüler aşı kompozisyonları geliştirilmiştir. Ancak mevcut aşılar, uzun soluklu immünite sağlama ve subklinik enfeksiyonları ortadan kaldırma konularında yetersiz kalmaktadır. Bu durum özellikle bağışıklık kazanmamış küçük çocuklarda olduğu kadar adölesanlar ve yetişkin bireyler için de tehlike oluşturmaktadır. Bu yüzden mevcut asellüler aşıların klinik etkinliğini artırmak için yüksek immün koruyucu özelliği taşıyan yeni proteinlerin bulunması önem arz etmektedir.Bu çalışmada, demir süperoksit dismutaz (FeSOD) proteininin, B. pertussis enfeksiyonuna karşı sağladığı koruyuculuk ve aynı zamanda humoral ve hücresel bağışık yanıtlarını tetikleme kapasitesi, fare modeli kullanılarak incelenmiştir. Bunun için öncelikle FeSOD proteinini kodlayan sodB geni, tüm dünyada kullanılan B. pertussis suşu `Tohama I' hücrelerinin genomik DNA'sından PCR yardımıyla çoğaltılıp sırasıyla pGEM®-T Easy klonlama ve pET28a(+) ekspresyon vektörlerine klonlanmıştır. Rekombinant pET28a(+)/sodB vektörü, E. coli BL21(DE3) hücrelerine aktarılmış ve burada IPTG indüksiyonu yoluyla protein ifadesi gerçekleştirilmiştir. İfade edilen FeSOD proteini daha sonra afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve önceki çalışmalarda tespit edilen immunojenitesi Western blot yöntemiyle teyit edilmiştir. FeSOD proteini daha sonra Al(OH)3 adjuvanıyla karıştırılmış ve bu karışım BALB/c farelerine, fare başına 20 ?g saflaştırılmış protein düşecek şekilde, intraperitoneal enjeksiyonla üç hafta arayla iki defa verilmiştir. Aynı şekilde diğer bir grup fare de B. pertussis inaktive tam hücre süspansiyonu ile bağışıklanmıştır. İkinci aşılamadan 10 gün sonra, B. pertussis lokal `Saadet' suşunun 2.5x109 cfu/ml'lik süspansiyonundan bağışıklanan her fareye 100 ?l'lik doz olacak şekilde intranazal yolla verilmiştir. Bu işlemi takip eden beşinci, sekizinci ve on dördüncü günlerde fare gruplarının akciğerleri alınmış ve farklı seyreltmelerle ekim yapılan ciğer homojenatlarından CFU sayımı yapılmıştır. Bunun sonucunda tam hücre aşılamasının B. pertussis enfeksiyonuna karşı tam koruma sağladığı, FeSOD immunizasyonunun ise bunu gerçekleştiremediği saptanmıştır. Koruyuculuk testinin yanı sıra, bağışıklanan farelerin serumu kullanılarak humoral bağışık yanıtı ELISA testi aracılığıyla tespit edilmiş, FeSOD aşılamalarının anti-FeSOD IgG üretiminde önemli ölçüde artışa sebep olduğu gözlenmiştir. Son olarak hücresel immun yanıtının tespiti, farelerin dalak örneklerinden kültür oluşturulup, kontrol ve aşılanmış farelerden elde edilen kültürlerin FeSOD proteininin eklenmesi üzerine ürettiği IFN-? miktarları karşılaştırılarak yapılmış ve tam hücre aşılamasının hücresel immun yanıtı önemli ölçüde tetiklediği görülürken aluminyuma adsorbe edilmiş FeSOD aşılamasının bunu gerçekleştirmediği görülmüştür.