Thesis Details

Glutatyon redüktaz enziminin biberiye bitkisinden ekstraksiyonu ve karakterizasyonu = Extraction and characterization of glutathione reductase enzyme from rosemary plant

Authors:

Tosun, Büşra

Publisher:

Sakarya Üniversitesi

Main Topics:

Biochemistry

Document Type:

Thesis

Program Type:

Master

Publication Date:

12/2018

Document Language:

Turkish

Document ID (Org No.):

2000017706

Descriptors:

BIOCHEMISTRY

Abstract

In this study, glutathione reductase enzyme (Glutathione: NADP+, oxidoreductase, E.C 1.8.1.7: GR) was extracted from the rosemary (Rosmarinus officinalis L.) plant and purified 18 times in 54.80% yield by optimized triple phase purification method. The purified rosemary GR enzyme molecular weight was monitored by SDS-PAGE as a single band of approximately 75 kDa. In the enzyme characterization studies, optimum ionic strength, temperature, pH, and kinetic properties were investigated by using raw extracts. Results are as follows; 400 mM phosphate buffer, 60°C, 7.5, and Km value of NADPH was 0.047 mM; Vmax was found to be 0.0033 EU/mL while Km value of GSSG substrate was 0.029 mM; Vmax was found to be 0.0019 EU/mL. The effects of magnesium, mercury, cobalt, iron, nickel, lead, barium, manganese, aluminum and calcium metals on the enzyme activity were investigated. Among these metals, Mg+2, Mn+2 and Al+3 metals increased the enzyme activity, while the most other metals exhibited inhibitory effect. As a result of storage stability, it was observed that the enzyme was unstable in the long term. In addition, the inhibitory effect of GSH on the GR enzyme from rosemary plant was investigated and the Ki value of GSH was found to be 38.03 mM with the Lineweaver-Bruk graph.

Bu çalışmada, glutatyon redüktaz enzimi (Glutatyon: NADP+, oksidoredüktaz, E.C. 1.8.1.7: GR) biberiye (Rosmarinus officinalis L.) bitkisinden ekstra edilerek üçlü faz saflaştırma yönteminin optimize edilmesi ile %54,80 verimle 18 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan biberiye GR enzimi molekül ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık olarak 75 kDa tek band olarak görüntülenmiştir. Enzim karakterizasyon çalışmalarında optimum iyonik şiddet, sıcaklık, pH ve kinetik özelliği araştırılmıştır. Sonuçlar sırasıyla; 400 mM fosfat tamponu, 60°C, 7,5 ve NADPH substratı Km değeri 0,047 mM; Vmaks ise 0,0033 EÜ/mL bulunurken, GSSG subsratı Km değeri 0,029 mM; Vmaks ise 0,0019 EÜ/mL şeklinde bulunmuştur. Magnezyum, cıva, kobalt, demir, nikel, kurşun, baryum, mangan, alüminyum ve kalsiyum metallerinin enzim aktivitesi üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu metallerden Mg2+, Mn2+ ve Al3+ metalleri enzim aktivitesinde artışa yol açarken, diğer çoğu metal ise inhibitör etki sergilemiştir. Depolanma kararlılığı sonucunda ise enzimin uzun vadede dayanıklı olmadığı gözlenmiştir. Buna ilaveten biberiye bitkisi GR enzimi üzerine GSH'ın inhibisyon etkisi incelenmiş ve GSH için Lineweaver-Burk grafiği yardımıyla Ki sabiti 38,03 mM olarak bulunmuştur.